مروری بر روش های ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار کشت سلول Elisa HI PCR
مقدمه:
روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار
یکی از شاخصه های مهم درمان تشخیص صحیح و سریع عامل عفونی می باشد.
هم اکنون علم تشخیص جایگاه رفیعی در علم پزشکی پیدا کرده و سالیانه میلیاردها دلار سرمایه در جهت پیشرفت این علم هزینه می‌شود.
در بیماریهای عفونی دستیابی به تشخیص صحیح باعث می‌شود که درمان توسط پزشک به نحو مطلوبی انجام گیرد.
که نتیجه آن ارتقاء سطح بهداشت عمومی و از سوی دیگر اعتماد و اطمینان بیمار و پزشک به آزمایشگاه است.
انواعی
از بیماریهای عفونی در انسان بوسیله ویروس ها ایجاد می شوند، برخی از این
بیماریها فوق العاده کشنده بود، مثل هاری، هپاتیت، ایدز، تبهای هموراژیک و
انسفالیت و برخی هم ناراحتیهای مختلفی در انسان ایجاد می‌کنند مثل
سرماخوردگی، اوریون، عفونت با هر ویروس ها برخی مثل سرخچه و سیتومگالو
ویروس ها ناهنجاریهای مادرزادی ایجاد می‌کنند بالاخره بعضی از ویروس ها
تومور و سرطان ایجاد می‌کنند.
شیوع روز افزون بیماری های ویروس اهمیت و استفاده از روشهای پیشرفته در تشخیص این عوامل را بیش از پیش مطرح می سازد.
در
سیر تکامل شعب مختلف علوم پزشکی رشته ویروس شناسی نیز مستثنی نبوده و
پیوسته محققین آن در حال تکاپیو و تحقیق هستند که حاصل تجربیات آنها
راهنمای ما در یافتن روشهای بهتر جهت تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای عفونی
است.
این دفتر تحت عنوان مروری بر روشهای ویروس شناسی با بررسی
روشهای معمول ویروس شناسی به علاقمندان این رشته و دانشجویان علوم
آزمایشگاهی و پزشکی تقدیم می‌گردد.
لازم است قید گردد این کتاب طوری طراحی شده و تنظیم شده که شخص علاقمند باید با مقدمات اولیه ویروس آشنایی داشته باشد.
فهرست مطالب:
مقدمه
روشهای مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای ویروسی برسه اصل استوار است
۱-۱ جداسازی ویروس
۱-۱- ب – جداکردن درکشت سلول
۱-۱-ج – کشت و جداکردن ویروس درحیوانات
۲-۱- تشخیص بیماریهای ویروسی توسط آزمایشهای سرمی
۳-۱- شناسایی بیماریهای ویروسی توسط آزمایشات ملکولی
تاریخچه تلقیح به تخم مرغ جنین دار
۲-۱- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنین دار
۲-۲ منبع تهیه تخم مرغ
۳-۲ علائم رشد ویروس
۴-۲ ساختمان تخم مرغ جنین دارد
اعمال غشاء الانتوئیک شامل:
۵-۲ رشد جنین درسنین مختلف
۶-۲ راههای تزریق
۷-۲ موارد استعمال تخم مرغ جنین دار SPF درتشخیص ویروسها
الف-ویروسهائی که درتمام قسمتهای تخم مرغ جنین دار رشد می کنند.
ب-ویروسهائی که روی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات شدید می کنند.
ج-ویروسهائی که روی پرده کوریولاانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات مختصر می کنند.
د-ویروسهای که درروی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحت نمی‌کنند.
ه-ویروسهائی که درحفره الانتوئیک رشد می کنند.
و-ویروسهائی که درحفره آمنیوتیک رشد می کنند .
ی – ویروسهائی که درکیسه زرده رشد می کنند.
۸-۲- روشهای مختلف کشت عوامل ویروسی درتخم مرغ جنین دار SPF
مقدمات تزریق
وسایل موردنیاز شامل
۹-۲ روش تزریق درحفره الانتوئیک
۱۰-۲ روش تزریق درحفره آمینوتیک
روش اول
روش دوم
روش سوم
۱۱-۲-تزریق در کیسه زرده
روش اول
روش دوم:
روش سوم
روش تزریق روی غشاء کوریوالانتوئیک
روش کار
۱۳-۲-برداشت مایعات و غشاء های آلوده به ویروس ازتخم مرغ جنین دار تزریق شده
۳-کشت سلول Cell Culture
1-3-مقدمه ای برکشت سلول
۲-۳- موارد سودمند کشت سلول:
۳-۳-مواردی که کشت سلول با اشکال مواجه می‌شود.
۴-۳-کشت سلول اولیه Primary cell culture
5-3-جدا نمودن نسج مورد استفاده جهت کشت سلول اولیه
۶-۳-(تهیه کشت سلول اولیه به روش explant)
7-3-تهیه سلول اولیه به روش آنزیمی
۸-۳-هضم آنزیمی به روش تریپسین گرم
۹-۳-هضم آنزیمی به روش تریپسین سرد
۱۰-۳-استفاده از آنزیم های دیگر جهت هضم نسج
آنزیم کلاژنازcollagenase
11-3-هضم مکانیکی
۱۲-۳-جداسازی سلولهای زنده و مرده
شرایط استرلیتی کار
آماده‌سازی محیط‌های مصرفی
بافر فسفات (-) PBS:
تریپسین ۱%:
۲ بافر فسفات (+) PBS:
محلول تریپسین- EDTA 2/0% :
محلول بی‌کربنات سدیم ۵/۷ :
سرم:
آنتی‌بیوتیک:
محلول پنی‌سیلین- استرپتومایسن:
ضد قارچ (AmphotericinB):
محلول L- Glutamine:
محلول تریپتوز فسفات براس (Tryptose phosphate Brath):
روش اول:
روش دوم:
محیط کشت MEM (Eagle) (قابل اتوکلاو):
محیط‌های لازم
لوازم لازم
روش کشت سلول فیبروبلاست
روش شمارش سلول بوسیله لام هماسیتومتر:
۱۳-۲-کشت سلول ثانویه، دیپلوئید:
۱۴-۳-هیستولوژی سلولهای دیپلوئید
۱۵-۳-خصوصیات رشد
۱۶-۳-منحنی رشد سلولهای دیپلوئید
۱۷-۳-رابطه بین ظرفیت تکثیر و مادر سلول
۱۸-۳-رابطه بین کشت سلولهای انسانی و سن(پدیده Hayflick)
19-3-کشت سلول معلق Suspension cell culcutre
1-کشت درظرف گردان Roller culture
2-کشت روی ریز ناقلها Microcarrier culture
3-کشت بصورت معلق Suspension
3-نگهداری
۴-نمونه گیری وبررسی وضعیت سلولها و محیط کشت:
۵-کدام سلولها؟
suspension یکنواختی تعلیق
۲۰-۳-روشهای کشت معلق:
۲۱-۳-روش Selection
ازمعایب این روش:
۲۳-۳-عادت دادن یاخته به شرایط تعلیق Adaptation
23-3-شرایط لازم برای انجام یک کشت معلق سلول
۱-سلول Cell:
2-محیط کشت Culture media:
Growth medium:
1-Chemical properties:
الف –نمکها Salts:
نمکهای مهم که دراسمولارینه محیط نقش داشته‌عبارتند از:
ب-کلوگز Glucose:
ج-AminoAcids:
د-Glutanmine:
هـ-Vitamins:
و-Serum:
و-۱-Protein
و-۲- Polypeptide:
و-۳-Hormons:
و-۴-Nutrient and Metabolite:
و-۵-Minerals:
2-physical properties
الف – PH
ب-buffering
ج-کاهش درجه حرارت با توجه به تاثیر PH درافزایش حلالیت Co2 موثر است.
۵-Viscosity
هـ-Sruface Tension and foaming
و-Osmolarity
24-3-خصوصیات محیط کشت سوسپانسیون:
۳-امکان تبادلات گازی Gas phase
4-همزن Agitation:
5-ظرف کشت Culture vessel
ظروف کشت استیل
۴ELISA -
1-4-مزیت تکنیک ELISA:
2-4-انواع روشهای ELISA:
3-4-مراحل کار در ASILE
A: مرحلة Coating
1- نوع و جنس میکروپلیت
۲- افزایش چسبندگی:
۳- Coating Buffer
B: مرحله اضافه نمودن نمونه (Sample Addition):
1- Blocking Buffer:
2- رقت (Dilution):
C: مرحله اضافه نمودن کانژوگه (Conjugate Addition):
1- کانژوگه (Conjugate):
D: مرحله اضافه نمودن سوبسترای آنزیم (Substrate Addition):
1- انواع سوبسترا:
E: مرحله توقف (Stopping Reaction):
F: مرحله خواندن جذب نوری (Reading):
1- ضریب تغییرات (CV):
2- Intera assay CV:
استفاده از Avidin و Biotin در ELISA:
“Hemagglutination Inhibition” (HI)
5-«ممانعت از هم اگلاتیناسیون»
روش آزمایش:
روش انجام آزمایش:
۵-۶-آزمایش PCR
آنزیم DNA Polymerase
داکسی نوکلئوتید تری فسفات
DNA الگو
غلظت یون منیزیم (Mg+2)
الف-اتصال پرایمر
ب-دمای تفکیک یا جداسازی DNA
ج-فعالیت آنزیم Taq DNA polymerase
5-6-5- پرایمرها
بافر PCR و کمک کننده ها
سیکلهای PCR
مرحله اتصال
مرحله ساخت
تعداد سیکل
۱) سریعتراست.
۲) به مقادیر کمتری از DNA درمقایسه با روش موسوم RFLP نیاز است.
۳) DNAرا می توان از بافتهای مختلف استخراج نمود.
۴) محصولات را می توان بدون کاربرد رادیو ایزوتوپها آشکار نمود.
بررسی محصولات PCR
سیستم های الکتروفورز